Наши разработки » Хемостат

\pagestyle{fancy}

%\tableofcontents % Печатает оглавление \section*{Наш адрес} \noindent Тренкеншу Рудольф Павлович\\ Боровков Андрей Борисович\\ Лелеков Александр Сергеевич\\[0.5em] Отдел биотехнологий и фиторесурсов\\ Институт биологии южных морей НАНУ\\ пр. Нахимова, 2\\ 99011 Севастополь,\\ Крым, Украина\\[1em] тел. (0692) 55-07-95, 096-876-36-65\\ e-mail: alex\_l\_83@mail.ru, spirit2000@ua.fm, trenkens@yandex.ru\\ \texttt{http://biotex.ibss.org.ua}

\section*{Ведение}

Существует два способа культивирования клеток: накопительный (периодический) и непрерывный. В случае накопительного способа выращивания в освещаемый культиватор, заполненный питательной средой, содержащей необходимые для роста биогенные элементы, вносится небольшое количество клеток микроводорослей (инокулят). Рост микроводорослей приводит со временем к увеличению концентрации клеток до некоторой максимальной плотности культуры. Эта плотность ограничена либо элементами минерального питания, либо интенсивностью света, либо накоплением метаболитов, либо другими физико-химическими условиями среды. Графически такой рост изображается S "--- образной кривой, форма которой зависит от условий, в которых выращиваются клетки и кинетических характеристик культуры микроводорослей.

Совсем иная картина будет наблюдаться при вмешательстве экспериментатора в процессы роста в любой фазе развития периодической культуры, например, при разбавлении культуры питательной средой. Картина роста будет зависеть от величины этого разбавления и используемой среды. При определенных условиях (неизменность биохимического состава, возрастной структуры популяции клеток, концентрации метаболитов и др.) динамика роста после разбавления будет повторять прежнюю. Процедуру разбавления можно повторять неоднократно, в результате чего в культиваторе будет наблюдаться непрерывный рост культуры. Подбирая относительные объемы и моменты разбавления можно управлять процессами роста микроводорослей.

Разбавление культуры представляет собой основу управления ростом микроводорослей. Причем управление ростом в культуре может осуществляться только по плотности культуры и времени, что следует из определения кинетических характеристик роста. Действительно, выбирая относительный объем разбавления можно уменьшать плотность культуры до необходимой величины, а, изменяя промежуток времени между разбавлениями, можно повышать плотность до необходимой за счет роста культуры. Ясно, что регулирование имеет пределы, определяемые внешними условиями и предельными видоспецифическими характеристиками роста микроводорослей.

В данной работе предлагается установка, которая обеспечивает рост культуры низших фототрофов как в накопительном режиме, так и в режиме хемостата при требуемых удельных скоростях протока. Установка может быть использована при организации лабораторных работ по изучению роста микроводорослей на биологических факультетах университетов, а также в качестве экспериментальных культиваторов при организации промышленного производства. Использование установки в научно-исследовательских институтах позволит получить новые знания о росте микроводорослей, причем результаты, полученные разными авторами для разных видов микроводорослей, будут сопоставимы благодаря одинаковым условиям роста культур.

\subsection*{Актуальность} Использование микроводорослей в научно-исследовательских и промышленных целях непрерывно расширяется. Различные виды водорослей служат источниками растительного белка, витаминов, хлорофилл-каротиноидных комплексов и т.\,д. Микроводоросли, в качестве объекта марикультуры, представляются перспективными объектами, прежде всего, как эффективные преобразователи световой энергии и как источники трофического назначения. Использование микроводорослей для доочистки сточных вод позволяет решить проблему возрастающей эвтрофикации поверхностных водоёмов. В связи с изложенными аспектами возникает вопрос о способах культивирования микроводорослей. Разработке систем культивирования микроводорослей посвящено немало литературы. Авторы предлагают разные виды конструкций, начиная от самых элементарных лабораторных культиваторов, заканчивая автоматизированными промышленными системами. Обычно в научно-исследовательских учреждениях в качестве лабораторных культиваторов традиционно используется химическая посуда. При этом, как правило, процедура измерения поверхностной радиации практически не учитывает расхождение форм освещаемых поверхностей. При перемешивании суспензии барботированием воздухом или газовоздушной смесью довольно приблизительно указывается количество воздуха на единицу объема перемешиваемой суспензии. Указанные обстоятельства не дают возможности корректного сравнения экспериментальных данных, например, для расчета кинетических характеристик роста микроводорослей.

Таким образом, создание унифицированной установки для культивирования микроводорослей позволит получить новые знания о процессах роста и накопления биохимических компонентов клетками микроводорослей.

\subsection*{Наша цель} На основе разработанной кинетической теории роста микроводорослей создать унифицированную систему культивирования, как некоторый стандарт, для использования в лабораторной практике студентов, преподавателей и научных сотрудников.

\subsection*{Требования к установке} Установка для культивирования микроводорослей должна удовлетворять следующим требованиям: \begin{enumerate} \item Все составные элементы системы разработаны на основе теоретических представлений о кинетике роста микроводорослей. Например, геометрия фотобиореактора должна быть такой, чтобы легко и довольно точно можно было рассчитывать важнейшие характеристики системы (фазы роста, объем, площадь освещаемой поверхности, интенсивность поверхностной радиации и др.). \item Все составные системы культивирования должны быть стандартного фабричного производства, чтобы в случае выхода из строя какого-нибудь элемента конструкции его замена не представляла бы трудностей. \item Простота и надежность конструкции. \item Контроль над основными параметрами процесса роста культуры микроводорослей и возможность простого управления ими. \item Минимальная стоимость всей системы культивирования. \end{enumerate}

\section*{Теоретическое обоснование конструкции}

Следует отметить, что все факторы, ограничивающие рост культуры микроводорослей, можно разделить на 3 категории: световые условия, газовое обеспечение и минеральные компоненты питательной среды. Общее влияние упомянутых факторов определяет форму накопительной кривой. Верно и обратное утверждение "--- по форме накопительной кривой можно судить о лимитирующих рост факторах, последовательности их действия.

Накопительную кривую можно разделить на следующие фазы роста: лаг-фаза, экспоненциальная (логарифмическая), линейная фазы, фаза замедления роста, стационарная фаза и фаза отмирания.

Максимальная удельная скорость роста культуры микроводорослей наблюдаются на экспоненциальной фазе: биомасса растёт по экспоненциальному закону, что подразумевает отсутствие лимитирующих факторов. Единственным ограничивающим фактором является величина внешнего светового потока. При увеличении освещённости (если минерального и газового субстрата достаточно) увеличится и удельная скорость роста культуры. В пределе, при некоторой пороговой освещённости, будет наблюдаться максимально возможная удельная скорость роста, величина которой определяется генетикой объекта культивирования. При снижении светового потока будет наблюдаться и снижение скорости роста культуры.

Удельная освещенность клеток складывается из поверхностной освещенности, которая обусловлена мощностью световой решетки (ламп), освещаемого слоя фотобиореактора (толщина фотобиореактора) и интенсивности перемешивания культуры. Для реализации максимальной скорости роста необходимы мощные лампы, тонкий освещаемый слой при активном перемешивании суспензии. Выполнение этих условий требует специального дорогостоящего оборудования. Поэтому нами в качестве стандарта выбрана световая решетка укомплектованная десятью недорогими 18~Вт лампами, обеспечивающая поверхностную освещенность 5--10~кЛк (21--42~Вт/$м^2$ на расстоянии 30--5~см от ламп).

Для обеспечения достаточного количества биомассы, для ежедневного отбора проб оптимальным является компромисс между толщиной освещаемого слоя и общим объёмом фотобиореактора при его небольших линейных размерах и весе. Опыт культивирования микроводорослей в отделе биотехнологий и фиторесурсов показывает, что минимальный объем фотобиореактора, обеспечивающий условное невмешательство в процессы роста, составляет 3 литра. Исходя из размера световой решетки и объёма культиватора, освещаемый слой фотобиореактора будет составлять 5~см. Для поддержания постоянства освещённости фронтальные стенки фотобиореактора требуется делать из стекла (стекло в отличие от оргстекла с течением времени не мутнеет). Также для увеличения удельной освещенности клеток боковые грани фотобиореактора необходимо делать зеркальными.

Максимальная продуктивность культуры наблюдается на линейной фазе. В соответствии с теорией о лимитирующих факторах, показано, что линейный рост возможен только в случае постоянства потока лимитирующего субстрата в систему культивирования. Свойством постоянства потока лимитирующего субстрата в систему культивирования, обладает только газовая составляющая в форме углекислого газа. Поэтому для обеспечения максимальной продуктивности необходимо увеличить подачу углекислого газа в фотобиореактор до максимального предела, который составляет 5~\% от газо-воздушной смеси. Реализация данного режима возможна при использовании стандартного аквариумного насоса, баллона с углекислотой и смесителя с обратным клапаном. Кроме снабжения клеток углекислотой, компрессор обеспечивает перемешивание суспензии для равномерного распределения клеток в культиваторе и, соответственно, равномерного освещения. Так же компрессор обеспечивает вынос кислорода, являющимся побочным продуктом фотосинтеза, и ингибитором роста. Для улучшения перемешивания нижняя грань фотобиореактора должна быть расположена под углом 25 градусов.

При подборе материалов установки необходимо учитывать не только их пригодность для исследования ростовых процессов культур микроводорослей, но и ценовой фактор. Так, например, установочную площадку лучше выполнить из пластика, цена которого в розничной торговле в несколько раз ниже ламинированных деревянных поверхностей. При этом пластиковые поверхности надежнее и долговечнее ламинированных в условиях постоянного контакта с водными растворами. При выборе материала вертикальных стоек установочной площадки желательно использовать металлические никелированные трубки, покрытие которых устойчиво к воздействию водных растворов. Для обеспечения непрерывного режима культивирования необходимо включить в конструкцию установки дозирующее устройство, емкости для питательной среды и сбора урожая. Наиболее простая, надежная и дешевая реализация дозирующего устройства представляет собой программируемое реле времени и электромагнитный проточный клапан. Преимуществом данной конструкции является возможность управления процессами роста культуры в широком диапазоне плотностей (скоростей), что необходимо для исследования влияния различных факторов внешней среды на рост и физиологическое состояние культуры низших фототрофов.

\section*{Краткое описание установки} Установка для культивирования микроводорослей состоит из установочной площадки, двух фотобиореакторов, систем освещения, термостабилизации, газообеспечения, а также системы обеспечения непрерывного режима культивирования (рис.~\ref{ris_1}).

\begin{figure}[htb] \begin{center} \includegraphics[width=0.45\textwidth]{eps/1.eps} \caption{Блок-схема установки. 1 "--- фотобиореактор; 2 "--- система освещения; 3 "--- система газообеспечения; 4 "--- система термостабилизации; 5 "--- система обеспечения непрерывного культивирования} \label{ris_1} \end{center} \end{figure}

Установочная площадка представляет собой настольную конструкцию размерами $1000\times800\times500$. Вертикальные стойки и их крепления выполнены из металлических никелированных трубок диметром 25~мм, а полки "--- из белого пластика толщиной 20~мм. На нижней площадке расположены два фотобиореактора и сливные емкости системы обеспечения непрерывного режима культивирования.

\begin{figure}[htb] \begin{center} \includegraphics[width=0.45\textwidth]{eps/2.eps} \caption{Общий вид установки для исследования низших фоторофов} \label{ris_2} \end{center} \end{figure}

На верхней площадке расположены емкости для питательной среды, компрессор, электромагнитный клапан. В центре верхней площадки сделано отверстие для подвода шлангов с воздухом к фотобиореактору и шлангов с питательной средой к электромагнитному клапану.

\textit{Фотобиореактор} представляет собой емкость из стекла размером $400\times200\times50$ (плоскопараллельный тип) с рабочей толщиной 50~мм, т.\,е. выполняется условие перпендикулярности вектора светового потока к поверхности $400\times200$. Рабочий объем реактора "--- 3~л.

\begin{figure}[htb] \begin{center} \includegraphics[width=0.45\textwidth]{eps/3.eps} \caption{Внешний вид фотобиореактора} \label{ris_3} \end{center} \end{figure}

Нижняя грань сделана под углом 25 градусов с целью улучшения перемешивания суспензии. Сверху фотобиореактор закрывается крышкой из стекла, в которой имеются 2 отверстия для подачи воздуха и питательной среды. Все стеклянные элементы фотобиореактора склеены аквариумным силиконом.

\textit{Система освещения.} В качестве источника света используется горизонтальная световая решетка, состоящая из 10 ламп дневного света General Electric F18W/54-765.

\begin{table} \begin{center} \caption{Зависимость поверхностной освещенности фотобиореактора от расстояния между лампами световой решетки и фотобиореактором.} \begin{tabular}{|c|c|c|c|c|c|c|} \hline Расстояние: реактор-лампы, см & 5 & 10 & 15 & 20 & 25 & 30 \\ \hline Облученность, Вт/$м^2$ & 10,5 & 9,6 & 8 & 7 & 6 & 5 \\ \hline Освещенность, кЛк & 42 & 39 & 31 & 29 & 24 & 21 \\ \hline \end{tabular} \end{center} \end{table}

\begin{figure}[htb] \begin{center} \includegraphics[width=0.8\textwidth]{eps/4.eps} \caption{Зависимость поверхностной освещенности фотобиореактора от расстояния до ламп световой решетки.} \label{ris_4} \end{center} \end{figure}

Корпуса ламп симметрично относительно краев закреплены на ламинированную ДВП размерами $900\times800$. Лист ДВП с помощью захватов закреплен на тыльную сторону металлического каркаса. Средняя освещенность на поверхности фотобиореакторов составляет 10~кЛк на расстоянии 5~см от ламп. Интенсивность поверхностной радиации можно регулировать, изменяя расстояние между лампами и фотобиореактором или устанавливая между ними нейтральные светофильтры.

\textit{Система газообеспечения.} Данный элемент установки обеспечивает перемешивание суспензии микроводорослей внутри фотобиореактора для равномерного распределения питательных веществ между клетками, а также подачу в фотобиореактор углекислого газа и вынос кислорода, являющегося побочным продуктом фотосинтеза. Основным элементом системы является аквариумный компрессор типа CR-40R с двумя выходами, производительностью 2~л/мин и максимальным давлением 0,022~МПа.

\begin{figure}[htb] \begin{center} \includegraphics[width=0.45\textwidth]{eps/5.eps} \caption{Компрессор CR-40R} \label{ris_5} \end{center} \end{figure}

С помощью гибкого силиконового шланга диаметром 5~мм воздух подается непосредственно в фотобиореактор через отверстие в крышке. На конце шланга закреплена стеклянная трубочка длиной 35~см, что обеспечивает подачу воздуха в нижнюю часть фотобиореактора.

Фотобиореактор оснащен системой охлаждения (водяной рубашкой) размерами $400\times200\times10$~мм. Во избежание образования воздушных пробок и пузырей внутри рубашки водяной ток направляется снизу вверх. Увеличение либо уменьшение скорости протока воды через водяную рубашку позволяет поддерживать температуру в фотореакторе на заданном уровне.

Система для обеспечения непрерывного режима культивирования обеспечивает рост микроводорослей в режиме хемостата. В качестве емкости для питательной среды используется 5-и литровый пластиковый бочонок. Основными элементами системы являются программируемое реле времени (FERON TM22) и электромагнитный клапан (CAMOZZI A331-1C2-А7Е).

\begin{figure}[htb] \begin{center} \includegraphics[width=0.45\textwidth]{eps/6.eps} \caption{Внешний вид реле времени и электромагнитного клапана} \label{ris_6} \end{center} \end{figure}

Реле времени подключается в розетку, расположенную на листе крепления ламп световой решетки. Электромагнитный клапан с помощью кронштейна крепится над фотобиореактором. Питательная среда через соединительный шланг самотеком поступает к электромагнитному клапану, который находится в нормально закрытом состоянии. При включении программируемого реле времени, на клапан подается напряжение 220~В, он открывается, и питательная среда поступает в фотобиореактор. Скорость подачи питательной среды регулируется с помощью ручки на клапане, а также программно, с помощью временного реле. В максимально открытом состоянии клапана за одну минуту в фотобиореактор поступает 120~мл питательной среды. Минимально возможное время между включением и выключением клапана составляет 1~мин и определяется программой на таймере. Система настроена на 10 включений в сутки продолжительностью 1~мин. Таким образом, максимальная удельная скорость протока составляет 0,4~$сут^{-1}$. Для увеличения скорости протока свыше 0,4~$сут^{-1}$ необходимо выставить на таймере время включения 2 или более минуты.

\textit{Измеритель освещенности.} Датчик "--- измеритель освещенности предназначен для определения количества световой энергии, падающей на поверхность фотобиореактора от люминесцентных ламп дневного света. Чувствительность датчика 100~мВ на 10~кЛк падающей радиации, что соответствует 40~Вт/$м^2$ для указанного источника излучения. Линейная зависимость между освещенностью и вольт-амперными характеристиками датчика сохраняется в пределах 0--200~мВ, то есть 0--20~кЛк, что и составляет измерительный диапазон прибора.

\begin{figure}[htb] \begin{center} \includegraphics[width=0.45\textwidth]{eps/7.eps} \caption{Внешний вид измерителя освещенности} \label{ris_7} \end{center} \end{figure}

Приёмником излучения в датчике является фотодиод ФД-263, имеющий максимальную спектральную чувствительность около 800~нм. Для коррекции спектральной чувствительности прибора в области максимального поглощения пигментами водорослей, во входном окне датчика использован компаундный светофильтр на основе эпоксидной смолы и порошка медного купороса. Результирующая спектральная чувствительность датчика имеет максимум 450--500~нм. Преобразование тока фотодиода в напряжение осуществляется с помощью резистора, которым также корректируется и чувствительность датчика. Датчик подключен к цифровому мультиметру DT-830B на диапазоне <<напряжение>>, а также может быть подключен к любому высокоомному вольт-метру.

\section*{Преимущество нашей разработки\\ над другими} Для исследования ростовых, биохимических и физиологических характеристик культур микроводорослей разработана установка, которая обеспечивает рост водорослей в накопительной и непрерывной культуре. Использование установки в ВУЗах и НИИ позволит получить данные о росте различных видов и штаммов водорослей в одинаковых условиях, что важно для сравнения их биологических свойств. А также позволит корректно сравнивать экспериментальные данные, полученные различными исследователями.

Основываясь на известных представлениях роста микроводорослей, создана оптимальная конструкция, которая обеспечивает контроль над основными параметрами роста и физиологического состояния, а также возможность простого управления ими. Отличительными особенностями данной разработки является простота, надежность конструкции и легкость замены элементов, а также дешевизна установки в целом.

\section*{Апробация установки} Установка успешно прошла испытания в отделе биотехнологий и фиторесурсов ИнБЮМ НАНУ (г.~Севастополь) при интенсивном культивировании нескольких видов микроводорослей относящихся к различнім систематическим группам. Например, на рисунке~8 представлена динамика роста культуры \textit{Dunaliella salina}. Экспоненциальная фаза роста продолжалась с момента начала эксперимента по вторые сутки. Линейная фаза роста продолжалась со вторых по пятые сутки. Фаза замедления роста продолжалась с пятых по 11 сутки, при этом была достигнута максимальная плотность культуры 1,45~г~АСВ/л. На 11 сутки эксперимента была установлена удельная скорость протока 0,42~сут$^{-1}$. При достижении плотностью культуры стационарного динамического равновесия на уровне 0,47~г~АСВ/л, на 23 день эксперимента удельная скорость протока была изменена на 0,2$^{-1}$. Это привело к увеличению плотности культуры и достижению ей стационарного динамического равновесия на уровне 0,98~г АСВ/л.

\begin{figure}[htb] \begin{center} \includegraphics[width=0.6\textwidth]{eps/8.eps} \caption{Динамика роста культуры \textit{Dunaliella salina}. Пунктиром отмечены моменты включения протока: 0,42 и 0,2~сут$^{-1}$, соответственно.} \label{ris_8} \end{center} \end{figure}

Таким образом, использование системы непрерывного культивирования позволило управлять плотностью дуналиеллы, что дает возможность для исследования различных режимов роста культур микроводорослей.

\end{document}